Selection of Salt-tolerant Callus and its Antioxidant Analysis in Vitis Amurensis

Zhao Ying　Yang Yiming　Zhang Baoxiang　Liu Yingxue　Li Changyu　Wang Yanli　Lu Wenpeng ^*

Institute of special animal and plant sciences of CAAS, Changchun, 130112

* Corresponding author, zhaoying01@caas.cn

Abstracts　In order to gain the salt-tolerant calli of Vitis amurensis, NaCl as the treated factor to select the calli induced from the leaf explants. Comparing the relative growth rate and status of calli under different NaCl concentrations, the critical concentration of 1.5% NaCl was determined. Meanwhile, the resveratrol content of calli was also the highest at this concentration, up to 1 580 µg·g ^-1 FW(fresh weight) after 3 weeks by 1.5% NaCl treatment, which was 3.13 times higher than calli without NaCl treatment. But the resveratrol content of calli decreased to 652 µg/g FW at the 2.0% NaCl concentration. Furthermore, the salt-tolerant calli of Vitis amurensis was obtained by alternate culture in salt-free and medium containing 1.5% NaCl for 3 times and subculture every 4 weeks. After treatment with 1.5% NaCl, the relative growth rate of salt-tolerant calli increased significantly, which was 6.09 times as much as that of the control calli, while the content of H₂O₂ decreased significantly, and the activity of antioxidant enzymes also increased significantly. It suggested that the salt-tolerant calli of Vitis amurensis might reduce the damage caused by salt by increasing the antioxidant level.

Keywords　Amur grape (Vitis amurensis), Callus, NaCl, Salt tolerance, Antioxidant

近年来，土壤盐渍化已成为危害全球农业生产的主要环境因素之一(Khan et al., 2000)。山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)作为东北地区葡萄酒酿造工业的主要原料，其果皮中的白藜芦醇具有抗氧化、抑制肿瘤活性等功效，酿造出的山葡萄酒深受消费者喜爱(艾军等, 2017, 中国农业出版社, pp.1-2)。但在山葡萄栽植过程中同样面临土壤盐渍化威胁，限制了优良山葡萄资源的栽培推广。因此，选育耐盐作物品种目前已成为开发利用盐碱荒地的关键。

目前，在盐胁迫生理机制研究方面，多以盆栽的完整植株为研究材料，采用高渗溶液法进行处理。这种研究方法易受环境、植株生长周期和取样部位等因素影响(王兰兰等, 2006)。植物愈伤组织具有脱分化和再分化潜力，同时组织培养方式处理受环境影响小，也是良种培育的理想途径(Larner and Seoweroft, 1981)。通过筛选耐盐愈伤组织获得耐盐再生植株，如耐盐水稻、烟草、苜蓿等品种，已成为耐盐品种选育的一种手段(高玉红和李云, 2004; 周荣仁等, 1989)。山葡萄作为木本植物，愈伤组织诱导本身具有一定难度，有关山葡萄耐盐愈伤组织筛选及其理化特性研究也未见报道。

在我们前期研究基础上，筛选出了山葡萄叶片外植体诱导愈伤组织的适宜培养基。本研究将在此基础上，以NaCl为选择因子，测定不同盐浓度下山葡萄愈伤组织相对生长率、组织培养情况及白藜芦醇含量，并在此基础上，确定耐盐愈伤组织筛选的临界盐浓度，初步筛选出白藜芦醇含量较高的耐盐愈伤组织，从细胞水平上探讨山葡萄耐受NaCl胁迫的生理机制，为优良耐盐山葡萄品种选育及高产优质栽培提供育种材料和理论依据。

1结果与分析

1.1山葡萄愈伤组织诱导及继代培养

将1 cm×1 cm山葡萄叶片外植体接种到愈伤组织诱导培养基上，2周后叶片外植体边缘开始出现愈伤组织(图1A)，4周后有大量浅黄色疏松型的愈伤组织产生(图1B)，无褐变情况发生，愈伤组织诱导率为100%。随后将诱导出的愈伤组织进行继代培养。

图1 山葡萄叶片愈伤组织诱导培养 Figure1 Calli were induced from leaf in amur grape

1.2不同浓度NaCl对山葡萄愈伤组织相对生长率的影响

从下方的图2可以看出，处理3周后0.5% NaCl对愈伤组织生长的抑制作用不显著，但NaCl浓度达1.0%后，随NaCl浓度的增加愈伤组织相对生长率大幅下降。其中1.5%和2.0% NaCl处理3周后，绝大部分愈伤组织褐变死亡，但在1.5% NaCl处理的部分变褐死亡的愈伤组织周围长出了新的愈伤组织团(图3)。

图2 不同浓度NaCl对山葡萄愈伤组织相对生长率的影响 注: CK (0.0% NaCl), T1 (0.5% NaCl), T2 (1.0% NaCl), T3 (1.5% NaCl), T4 (2.0% NaCl) Figure 2 Effects of different NaCl concentrations on the relative grow rate of calli in amur grape Note: CK (0.0% NaCl), T1 (0.5% NaCl), T2 (1.0% NaCl), T3 (1.5% NaCl), T4 (2.0% NaCl)

图3 不同浓度NaCl对山葡萄愈伤组织生长的影响 注: CK (0.0% NaCl)；T1 (0.5% NaCl)；T2 (1.0% NaCl); T3 (1.5% NaCl); T4 (2.0% NaCl) Figure 3 Effects of different NaCl concentrations on the growth of calli in amur grape Note: CK (0.0% NaCl); T1 (0.5% NaCl); T2(1.0% NaCl); T3 (1.5% NaCl); T4 (2.0% NaCl)

1.3不同浓度NaCl对山葡萄愈伤组织白藜芦醇含量的影响

由图4可以看出，随培养基中NaCl浓度的增加白藜芦醇含量逐渐增加，当培养基含有的NaCl浓度达到1.5% (T3)时，愈伤组织中的白藜芦醇含量达到最高为1 580 µg/g FW，显著高于其它NaCl浓度中培养的愈伤组织(p < 0.05)。NaCl浓度为2.0% (T4)时，愈伤组织中的白藜芦醇含量则又大幅下降，基本接近对照(CK)。

图4 不同浓度NaCl对山葡萄愈伤组织白藜芦醇含量的影响 注: CK (0.0% NaCl); T1 (0.5% NaCl); T2 (1.0% NaCl); T3(1.5% NaCl); T4 (2.0% NaCl) Figure 4 Effects of different NaCl concentrations on the resveratrol of calli in amur grape Note: CK (0.0% NaCl); T1 (0.5% NaCl); T2 (1.0% NaCl); T3 (1.5% NaCl); T4 (2.0% NaCl)

1.4山葡萄耐盐愈伤组织的初步筛选

根据不同NaCl浓度下愈伤组织的相对生长率及白藜芦醇含量，确定1.5 % NaCl为耐盐愈伤组织诱导的临界盐浓度。利用方法3.3进行耐盐愈伤组织筛选并获得耐盐愈伤系。与普通愈伤组织相比，耐盐愈伤组织在含1.5% NaCl培养基上处理1个月后，有大量新的愈伤组织诱导产生，而对照愈伤组织大部分已褐变死亡(图5)。耐盐愈伤组织的相对生长率也明显高于对照愈伤组织(p<0.05)，是对照愈伤组织的6.09倍(图5)。

图5 山葡萄耐盐愈伤组织的初步筛选 Figure 5 Effects of different NaCl concentrations on the growth of calli in amur grape

1.5 山葡萄耐盐愈伤组织生理特性分析

在含1.5% NaCl培养基上胁迫处理2周后，发现耐盐愈伤组织的H₂O₂含量明显小于对照愈伤组织中的过氧化氢(hydrogen peroxide, H₂O₂)含量(p<0.05)。相比于对照，耐盐愈伤组织中的H₂O₂含量下降了33.78% (图6A)。

而三种抗氧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)和过氧化物酶(peroxidase, POD)的活性则是耐盐愈伤组织明显高于对照愈(p<0.05)，相比于对照，耐盐愈伤组织中的SOD、CAT和POD活性分别高出了150.23%、60.71%和54.29% (图6)。

图6 山葡萄耐盐愈伤组织与对照愈伤组织生理特性比较 注: A: 过氧化氢含量比较; B: SOD活性比较; C: CAT活性比较; D: POD活性比较 Figure 6 Comparison on the physical characterization between salt-tolerant calli and control calli of amur grape Note: A: Comparison of H2O2 content; B: Comparison of SOD activity; C: Comparison of CAT activity; D: Comparison of POD activity

2讨论

有研究表明，直接高盐胁迫下筛选到的耐盐愈伤组织或植株才有可能为真正的耐盐突变体(张建华等，2002)。张新果等(2008)以药蒲公英叶片为外植体诱导愈伤组织，以NaCl为选择因子，从愈伤组织中成功筛选到了药蒲公英耐盐变异体。本试验采用直接筛选的方法获得了耐1.5% NaCl的山葡萄耐盐愈伤组织。

植物愈伤组织在NaCl胁迫下的直接表现是生长减缓(陆卫和贾敬芬, 1994)，这在本研究中也得到了证实。而筛选出的耐盐山葡萄愈伤组织在高盐胁迫下的相对生长率得到大幅提升，是普通山葡萄愈伤组织的6.09倍。植物在盐胁迫下的生理响应变化可反映其耐盐适应机制。山葡萄愈伤组织中的白藜芦醇含量随着NaCl浓度的升高呈先升高后下降的趋势，在1.5% NaCl胁迫下白藜芦醇含量达到最高。白藜芦醇具有抗氧化作用，可清除自由基(杜彬和孟宪军, 2006; Yang et al., 2009)。

一般情况下，耐盐植物通过启动自身的抗氧化系统，来有效清除盐胁迫产生的活性氧，从而减轻氧化伤害(杨颖丽等, 2008; Rahnama and Ebrahimzadeh, 2005)，是植物对逆境胁迫的一种适应性反应。Shalata等(2001)就指出，NaCl胁迫下番茄品种的耐盐性与其抗氧化酶活性密切相关。本试验结果表明，在1.5% NaCl的胁迫处理下，耐盐山葡萄愈伤组织的H₂O₂含量与普通山葡萄愈伤组织相比明显降低(图6A)，其三种抗氧化酶SOD、CAT和POD活性则显著升高。抗氧化酶SOD具有催化作用，可以使逆境胁迫下植物中产生的超氧自由基(Superoxide radical, O₂^-)转化为H₂O₂，过量的H₂O₂可在CAT和POD协同作用下被清除，有利于提高愈伤组织细胞对盐胁迫的适应能力(李会云和郭修武, 2008; Zhang and Shi, 2013; 宋靓苑等, 2020)，张新果(2008)、陆卫和贾敬芬(1994)等学者的研究也证实了此类耐盐适应机制，这在一定程度上消除了高盐胁迫下生长抑制的发生。因此，耐盐山葡萄愈伤组织在高盐胁迫下仍有大量愈伤组织诱导产出，未受到明显抑制。

3材料与方法

3.1山葡萄愈伤组织诱导培养

以山葡萄(Vitis amurensis)为试材，6月份初生长季从国家果树种质左家山葡萄圃(田间)中剪取生长正常、无病虫害的新梢带回实验室，将展叶新梢剪成小段，放入少量洗衣粉水中摇晃10 min，流水冲洗20 min，取叶片于超净工作台上用0.1%升汞表面消毒1 min，无菌水冲洗5次后，将消毒的叶片剪成1 cm×1 cm，作为外植体接种在MS+2.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤(N-(Phenylmethyl)-9H-purin-6-amine, 6-BA)+0.05 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D)培养基上进行愈伤组织诱导培养(赵滢等, 2018, 中国专利, ZL201611075162.7)。培养基中蔗糖含量为30 g/L，琼脂含量为6 g/L，pH为6.0。且愈伤组织继代培养基与诱导培养基相同。

3.2盐分对山葡萄愈伤组织相对生长率的影响

将诱导出的愈伤组织继代培养4次后，切成0.5 cm左右的小块分别接种到含0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0% NaCl浓度的培养基中，每个浓度接种10瓶，每瓶10块愈伤组织。培养3周后，参照张新果等(2008)方法统计山葡萄愈伤组织的相对生长率。相对生长率(%)=[愈伤组织鲜重(g)−愈伤组织的原始重量(g)]/愈伤组织的原始重量(g)。统计后的愈伤组织用液氮迅速冷冻，研磨成粉末，于-80℃的超低温冰箱中保存，用于白藜芦醇含量的测定。

3.3山葡萄耐盐愈伤组织的初步筛选

参照张新果等(2008)方法，略有改进。在1.5% NaCl培养基上培养的部分褐变死亡的愈伤组织周围长出了新的愈伤组织团，将长出的愈伤团接种到新的无盐培养基上扩增后，接种到新的含1.5% NaCl培养基上，再次将其转到无盐和含1.5% NaCl的培养基交替培养(每4周继代1次, 共交替继代3次)。

测定1.5% NaCl培养基上接种2周的耐盐愈伤组织与普通愈伤组织的过氧化氢含量和抗氧化酶活性；接种1个月后，统计耐盐愈伤组织与普通愈伤组织的相对生长率。

3.4生理指标测定

3.4.1白藜芦醇含量

白藜芦醇含量测定参照张庆田等(2011)方法。称取0.5 g愈伤组织粉末，加入5 mL甲醇研磨，避光提取12 h后，0.45 mm微孔滤膜过滤，获得的滤液采用高效液相色谱法测定白藜芦醇含量。Agilent-2100型液相色谱色谱条件：色谱柱Zorbax反相C₁₈柱，250 mm×4.6 mm，5 µm；流速1 mL/min；柱温30℃；检测波长306 mm，288 mm；梯度洗脱为流动相A：水；流动相B：乙腈。洗脱程序：0~10 min，B为5~15 %；10~20 min，B为15~30 %；20~30 min，B为30~50 %；30~35 min，B为50~100 %；34~40 min，B为100~5 %；40~45 min，B为5 %。

3.4.2过氧化氢、抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量测定

过氧化氢(H₂O₂)和可溶性蛋白含量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性测定参照Song等(2006)方法。

3.5数据分析

采用SAS 9.0软件对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和差异显著性检验(LSD法, α=0.05)。

作者贡献

赵滢为本试验的主要设计者和主要完成人，并完成文章初稿的撰写；杨义明，张宝香，刘迎雪和李昌禹参与了相关研究内容；王衍莉参与试验数据分析；路文鹏指导了本试验，完成了论文最终修改工作。全体作者均已阅读并同意最终的文本。

致谢

本项目由“国家科技资源共享服务平台”子平台(NICGR-2019-058)，中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1610342020001)，吉林省科技厅项目(20200402076NC)和吉林省科技厅项目(20191101030YY)共同资助。

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